Study of Bacillus thuringiensis behaviour in food environment by genome – wide transcriptome analysis

Bacillus thuringiensis è un batterio formante spora, che appartiene al gruppo dei Bacillus cereus. Fu inizialmente caratterizzato per la sua capacità di produrre un cristallo parasporale attivo contro diverse specie di insetti appartenenti agli ordini Lepidotteri, Ditteri e Coleotteri. Grazie alla sua attività insetticida, viene utilizzato in tutto il mondo in silvicoltura e agricoltura per il controllo degli infestanti. Studi recenti riportano la presenza di determinanti genetiche per fattori di virulenza di B. cereus, come l’emolisina BL (HBL), l’enterotossina non emolitica (NHE), la citotossina K e l’enterotossinaT, in ceppi di B. thuringiensis. Poichè ceppi commerciali di B. thuringiensis sono stati rinvenuti sotto forma di spora in derrate alimentari trattate, è parso importante approfondire i potenziali rischi derivanti dalla presenza di questo batterio nella catena alimentare. Studi filogenetici basati sull’analisi dei geni cromosomici, hanno dato esiti contrastanti e, ad oggi, non è chiaro se B. cereus e B. thuringiensis possano essere considerati varietà della stessa specie o due specie differenti. Questo lavoro di tesi è stato condotto con l’obiettivo di approfondire le conoscenze sul comportamento di microrganismi appartenenti al genere Bacillus presenti in prodotti alimentari di origine vegetale, con l’ausilio delle nuove tecnologie molecolari basate sullo studio del genoma e riservando particolare attenzione ai ceppi di B. thuringiensis impiegati come base per bio-pesticidi. L’analisi del profilo patogenico di 10 ceppi di B. thuringiensis presenti in commercio, ha evidenziato un’elevata distribuzione dei geni nhe, hbl, bceT e cytK codificanti per 4 noti fattori di virulenza di B. cereus. I geni enterotossici sono stati individuati tramite tecnica di PCR in tutti i ceppi analizzati. L’analisi con RT-PCR ha evidenziato l’espressione di tutti i geni delle enterotossine. La produzione della tossina HBL è stata confermata con il test RPLA per un ceppo appartenente alla sub-specie kurstaki ampiamente utilizzato per prodotti bio-pesticidi. Queste caratteristiche, e le difficoltà di discriminazione tra B. cereus e B. thuringiensis, hanno suggerito la possibilità che il ruolo di B. thuringiensis nelle intossicazioni alimentari associate a B. cereus, sia stato sottostimato. Un punto importante di questo studio, ha riguardato lo sviluppo di un modello alimentare a base vegetale che consentisse di studiare il comportamento di spore di B. thuringiensis dopo la simulazione di un trattamento industriale. Le tecniche di microscopia a scansione e della microanalisi a raggi X, sono state applicate al modello alimentare, con lo scopo di analizzare la superficie delle spore di B. thuringiensis e la loro capacità di interazione con la matrice alimentare. Particolare attenzione è stata riservata allo studio dei cambiamenti morfologici e chimici delle spore di B. thuringiensis durante il processo di germinazione nel modello alimentare. E’ stata osservata una rapida evoluzione del ciclo biologico di B. thuringiensis rispetto ad altri microrganismi formanti spora come alcune subspecie appartenenti al genere Clostridium (Bassi et al. personal communication). L’esocrescita delle cellule vegetative e il livello massimo di duplicazione cellulare, sono stati raggiunti entro due ore dall’attivazione delle spore in alimento. La tecnica dell’RT-qPCR è stata utilizzata per quantificare l’espressione, in alimento, delle determinanti genetiche per i fattori di virulenza responsabili delle intossicazioni alimentari attribuite a B. cereus. I trascritti delle enterotossine sono stati individuati, in quantitativi variabili, durante tutti gli stadi di crescita considerati, evidenziando un forte incremento durante la fase di crescita logaritmica del microrganismo oggetto di studio. La produzione della componente L2 dell’enterotossina HBL, coinvolta nella sindrome diarroica, nel modello alimentare, è stata determinata, anche se a bassi quantitativi, già durante l’inizio della fase di crescita logaritmica. Queste osservazioni hanno dimostrato la capacità di B. thuringiensis di completare un intero ciclo biologico in una matrice alimentare, sottoposta alla simulazione di un processo industriale, dando luogo alla produzione di enterotossine, come già osservato in terreni di laboratorio. Al fine di gestire i rischi connessi alla possibile presenza di B. thuringiensis nel settore alimentare, si è deciso di procedere con l’identificazione e l’inattivazione di sistemi generali di regolazione della virulenza, attraverso la costruzione di mutanti nulli. Accanto al tradizionale sistema della ricombinazione omologa, è stato considerato un meccanismo innovativo che sfrutta la mobilità degli introni del gruppo II, per generare inattivazioni geniche altamente specifiche. Sebbene siano stati eseguiti numerosi esperimenti, nessuno ha condotto all'inattivazione cromosomica desiderata. Nel tentativo di porre le basi scientifiche per la gestione dei rischi associati alla germinazione delle spore di B. thuringiensis nei prodotti alimentari, e per ottenere più informazioni sul ciclo di vita di questo microrganismo, è stata effettuata un’analisi microarray del trascrittoma di B. thuringiensis in 4 diverse fasi del ciclo biologico nel modello alimentare: da spora dormiente a cellule vegetativa/sporulante. E’ stato possibile confermare che l'mRNA è un componente delle spore batteriche ed evidenziare come le spore siano equipaggiate con una grande quantità di trascritti, probabilmente utili a fronteggiare le prime fasi del processo di germinazione. Le spore dormienti contengono ribosomi; durante i primi 40 minuti dopo l'attivazione della spora, la sintesi di rRNA e proteine ribosomiali aumenta fortemente. Una significativa e determinante attivazione di geni polifunzionali è stata osservata nelle spore in germinazione: la maggior parte dei geni coinvolti nell’attività metabolica (house-keeping, fattore d’inizio della traduzione, proteine ribosomali e fattori di allungamento) sono risultati indotti in questa fase dell’analisi microarray. Nelle cellule vegetative di B. thuringiensis sono stati individuati un elevato numero di trascritti per proteine coinvolte nella regolazione di differenti processi biologici, compresi la resistenza a differenti composti anti-microbici e ad agenti di stress ossidativo. E’ stato ipotizzato che le cellule di B. thuringiensis attivino questi sistemi, in risposta a stimoli esterni, come meccanismo di difesa e adattamento alle condizioni ambientali rinvenute nel modello alimentare. In accordo con i dati riportati in letteratura, i geni associati alla virulenza di B. cereus, sono risultati indotti nell’analisi microarray, specialmente durante la tarda fase di crescita cellulare. L’analisi trascrittomica si è dimostrata non solo un metodo idoneo per lo studio del processo di germinazione ed esocrescita delle spore di B. thuringiensis, ma anche un sistema utile per valutare il comportamento di batteri patogeni in alimento. I dati ottenuti hanno permesso di approfondire le conoscenze sulla versatilità metabolica di B. thuringiensis facendo emergere le caratteristiche di virulenza di questo potenziale patogeno alimentare. Dal momento che B. thuringiensis è ampiamente utilizzato in agricoltura biologica, dovrebbe essere efettuato un attento monitoraggio dei ceppi impiegati. In letteratura sono diffusamente riportati i rischi associati al patogeno alimentare B.cereus, ma quelli relativi a B. thuringiensis sono spesso sottovalutati. Dai dati ottenuti in questo studio, si potrebbe insinuare che B. thuringiensis sia responsabile di parte dei focolai di tossinfezione alimentare attribuiti a B. cereus: i produttori alimentari e le autorità responsabili per la sicurezza alimentare, dovrebbero dunque considerare il potenziale rischio associato alla presenza di residui di biopesticidi a base di B. thuringiensis nella catena alimentare.

Bacillus thuringiensis is a spore forming bacterium that belongs to the Bacillus cereus family. It was first characterized for its ability to produce a parasporal crystal active against several insect species, especially Lepidoptera, Diptera, and Coleoptera. Due to its insect activities it is worldwide used in forestry and agriculture to control pests. Recent studies showed that most of the genetic determinants for B. cereus virulence, such as haemolysin BL (HBL), non haemolytic enterotoxin (NHE), cytotoxin K, and bc-D-ENT enterotoxin, are harboured by B. thuringiensis strains. Since B. thuringiensis can contaminate food, being residual in spore form after treatment in the fields, it is ever more urgent to deepen investigate the potential risks arising from the presence of B. thuringiensis in food industry. Phylogenetic studies based on the analysis of chromosomal genes bring controversial results, and it is unclear whether B. cereus and B. thuringiensis are varieties of the same species or different species (Ivanova et al. 2003). Hence, what may seem to be a minor problem of taxonomy may therefore have serious implications for virulence and pathogenicity. This work of thesis was aimed to achieve a deeper scientific information on the food-associated Bacilli, taking the advantage of new genome based molecular approaches, focusing the attention on B. thuringiensis strains used as commercial biopesticides. The in vitro pathogenic profile of ten commercial B. thuringiensis strains, was characterised by the high distribution of the nhe, hbl, bceT and cytK genes, coding for respectively four B. cereus associated virulence factors. Enterotoxin genes were detected by PCR in all the strains analyzed. RT-PCR analysis confirmed the enterotoxin genes expression. Toxin productions was detected by RPLA test in the strains belonging to the widely used subsp. kurstaki. These features and the difficult discrimination between B. thuringiensis and B. cereus, suggested that the role of B. thuringiensis in outbreaks of foodborne disease may have been underestimated. The development of a vegetable based food model, that would allow to asses the behaviour of B. thuringiensis spores, after the simulation of an industrial processing treatment, was an important point in this study. The analysis of Bacillus spore envelope, and its ability to interact with food environment, have been performed using SEM and SEM X-ray microanalysis applied to the food model proposed. In more detail, particular attention was devoted to morphological and chemical changes of B. thuringiensis spores during germination process in food. We observed a rapid evolution of the B. thuringiensis biological cycle compared to that of other spore forming bacteria like Clostridium spp. (Bassi et al. 2008, personal communication). Interesting was that only two hours after spore activation, cell outgrowth was completed and cell division was at the maximum level. RT-qPCR analysis were performed to quantify the expression, in food, of the major virulence genes involved in B. cereus-associated food borne disease. Toxin mRNAs were detected, in variable amounts, at all investigated growth stages of B. thuringiensis, with a strong increase during the log phase of microorganism growth. Although no information on the B. cereus toxin expression in food are available, previous in vitro studies on B. cereus enterotoxins production, reported that the highest toxin level is achieved during the late log/early stationary phase. The production of the L2 component of HBL enterotoxin, involved in the diarrhoeal syndrome was detected in food model, even in low amount, during the early log phase. We concluded that B. thuringiensis can complete an entire life cycle in food systems after an industrial processing simulation, producing enterotoxins as observed in broth cultures. Given this finding, the need to identify systems for manage the risks associated with B. thuringiensis in industrial fields has became clear. An experimental approach was described in this work of thesis. Identification and inactivation of general systems for regulating virulence, through null mutants construction, were considered to evaluate changes in growth performance, cellular metabolism and toxins expression, in the studied microorganism. Besides homologous recombination, the mobility mechanism of group II introns were assessed to generate highly specific chromosomal gene disruption in B. thuringiensis. A novel approach and several experiments were performed to achieve the desired chromosomal inactivation, however no attempts gave the expected results. In order to manage risks associated with B. thuringiensis outgrowth in foodstuffs, and to gain more information on its life cycle, a microarray transcriptome analysis of B. thuringiensis in four different stages of the biological cycle, was performed from dormant spore to vegetative/sporulating cells. We could emphasized that mRNA is a component of bacterial spores. We discovered that spores are equipped with a large amount of transcripts probably useful to front the next steps of outgrowth. Dormant spores contained populations of ribosomes; during the first 40 minutes after spore activation, rate of both rRNA and ribosomal proteins synthesis strongly increased. A basic and strong activation of polyfunctional genes seemed to begin in germinant spores: most of the genes involved in the metabolic activity (house-keeping genes, translation initiation factor, ribosomal proteins, and elongation factors) were overrepresented at this time in microarray analysis. A large number of transcripts for protein involved in the regulation of different biological process, including resistance to different antimicrobial compounds and oxidative stress agents, were found to be present in B. thuringiensis vegetative cells. We hypothesized that B. thuringiensis cells may activate these systems in response to external stimuli for cell defence and adaptation to changing environmental conditions in food model. The transcripts for germination proteins (ger type) found in spore, are an index of the expression of this genes in previous sporulation stage and suggested the importance during dormancy, to monitor the environment for proper outgrowth conditions. This finding could explain the ability of B. cereus-like microrganism to occupy and complete a full life cycle within several different environmental niches. According to literature data, all the associated virulence genes, represented in microarray analysis, were up-regulated especially during the late stage of cell growth. Transcriptomic has been demonstrated to be not only a powerful tool to study the germination and outgrowth of B. thuringiensis spores, but also a suitable method to assess the environmental response to bacterial pathogens in food. Data obtained, provide new basic knowledge on Bacillus cereus group. These data extends our knowledge on the metabolic versatility of B. thuringiensis and also added to our view of virulence traits of this potential food-pathogen. Since B. thuringiensis is widely used and popular in biological farming, a careful monitoring of the strains used should be justified. Literature reports widespread the risks associated with the food-pathogen B. cereus, but those related to B. thuringiensis are often underestimated. From data obtained in this study we could assume that B. thuringiensis could actually be responsible for many of the food borne outbreaks previously attributed to B. cereus; taking this enterotoxigenic potential into account, as well as the fact that B. thuringiensis cannot be separated from B. cereus at the chromosomal level, food producers and food authorities, responsible for food safety, should consider the risk of B. thuringiensis insecticide residue in the food chain.