Gli acidi biliari sono molecole derivanti dal colesterolo le quali, assieme con fosfolipidi, colesterolo e bilirubina rappresentano i principali costituenti della bile. Gli acidi biliari sono molecole detergenti le quali, nel tratto intestinale, favoriscono l’emulsione dei grassi migliorandone così l’assorbimento da parte dell’epitelio intestinale. Recentemente è stato scoperta un’altra importante funzione degli acidi biliari legata al loro ruolo in molti processi di signalling. Alcuni recettori degli acidi biliari sono stati identificati e sono stati riportati diversi disordini metabolici legati a difetti negli eventi di segnalazione dipendente da acidi biliari. Gli acidi biliari sottostanno, nel corpo, ad un processo di ricircolo tra l’intestino ed il fegato chiamato “circolazione enteroepatica” il quale garantisce il recupero ed il successivo riutilizzo di queste molecole. Il trasporto degli acidi biliari è realizzato, negli enterociti e negli epatociti, principalmente attraverso un meccanismo mediato da proteine trasportatrici e coinvolge trasportatori trans-membrana e intracellulari. In questo studio è stato caratterizzato, attraverso spettroscopia NMR, il trasportatore intracellulare di acidi biliari di fegato di pollo (cL-BABP). cL-BABP è una proteina solubile di circa 14 KDa la cui struttura tridimensionale è costituita da un barile beta con 10 filamenti e un motivo helix-turn-helix che copre la regione aperta del barile. Nella prima parte del progetto è stata studiata la stabilità ed il meccanismo di unfolding di cL-BABP. La stabilità strutturale è stata analizzata attraverso esperimenti di scambio idrogeno/deuterio (XH) ed è stato stimato il ΔGop. Il meccanismo di unfolding è stato studiato in maniera residuo specifica attraverso esperimenti NMR di titolazione con urea e i risultati sono stati confrontati con i dati disponibili per altri membri della stessa famiglia proteica. Nella seconda parte del progetto è stato prodotto e analizzato un mutante di cL-BABP (H98Q) in cui l’istidina in posizione 98 è stata sostituita con un residuo di glutammina allo scopo di studiare il ruolo di tale residuo nell’avviare il meccanismo di legame allosterico. La struttura globale della proteina è risultata sostanzialmente inalterata dalla mutazione, nonostante la stabilità risulti leggermente ridotta. L’analisi delle variazioni dei chemical shift tra la proteina WT ed il mutante ha rivelato la presenza di effetti a lunga distanza nel segmento 55-59 il quale risulta in contatto con un ligando. L’analisi della capacità di legame, studiato attraverso NMR e spettrometria di massa (MS), ha indicato una rottura del meccanismo di legame cooperativo evidente come una riduzione dell’affinità di legame per un ligando. La perdita di affinità per un ligando è stata confermata anche attraverso il confronto del coefficiente di diffusione (D) per i ligandi tra WT e H98Q. Nel corso del progetto è stata inoltre studiata la mobilità attraverso la misura NMR dei parametri di rilassamento T1 e T2. L’effetto principale della sostituzione è stato lo smorzamento dei moti lenti osservati nella regione C-terminale nella proteina WT. L’ultima parte del progetto è stata focalizzata sulla caratterizzazione, via NMR, dell’interazione di cL-BABP con vescicole anioniche in presenza del ligando fisiologico, cioè acido glicochenodeossicolico (GCDA). Inizialmente l’associazione con vescicole anioniche, cioè liposomi di 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), è stata analizzata in assenza di acidi biliari ed è stata confermata la natura elettrostatica dell’interazione. Successivamente è stato studiato il complesso ternario cL-BABP/DMPG/GCDA. L’analisi di diversi esperimenti NMR di titolazione ha indicato che cL-BABP si associa con liposomi di DMPG nella condizione apo, mentre l’interazione è indebolita nella forma olo. Infatti l’aggiunta del ligando fisiologico alla miscela proteina-liposoma modula l’interazione, spostando l’equilibrio verso la forma olo libera della proteina. Quindi membrana e ligandi sono in competizione per l’interazione con cL-BABP. Questi risultati supportano un meccanismo di legame e rilascio dei ligandi controllato dal gradiente di concentrazione di sali biliari presente nelle cellule epatiche polarizzate. I dati ottenuti dallo studio di H98Q hanno permesso di chiarire il ruolo chiave dell’istidina 98 nella modulazione della mobilità osservata in cL-BABP e la sua importanza nel determinare un efficiente legame cooperativo degli acidi biliari. È stato infine proposto, sulla base dei dati di interazione con liposomi, un meccanismo per il trasporto intracellulare degli acidi biliari nelle cellule epatiche che tiene conto del gradiente intracellulare di acidi biliari.

Bile acids are cholesterol derived molecules which, together with phospholipids, cholesterol and bilirubin, represent the principal constituents of bile. Bile acids are detergent molecules which, in the intestinal tract, help the emulsification of fat, thus improving its absorption by the intestinal epithelia. Recently another important bile acid function has emerged linked to their role in many signalling processes. Some bile acid receptors have been indeed identified and several metabolic disorders, related to impaired bile acid dependent signalling, have been reported. Bile acids undergo, in the body, a recycling pathway between the intestine and the liver, called “enterohepatic circulation”, which assure the recovery of these molecules and their subsequent reutilization. Bile acids transport is achieved, in the enterocytes and in the hepatocytes, mainly through a protein mediated mechanism that involves transmembrane and intracellular transporters. In this study the intracellular bile acid transporter from chicken liver (cL-BABP) has been characterized through NMR spectroscopy. cL-BABP is a soluble protein of about 14 KDa with the three-dimensional structure represented by a 10 stranded beta barrel with a helix-turn-helix motive that covers the open end of the barrel. In the first part of the project the stability and unfolding mechanism of cL-BABP was investigated. The structural stability was analyzed through hydrogen-deuterium (HX) exchange experiments and the ΔGop was estimated. The protein unfolding mechanism was also investigated in a residue specific manner through urea titration NMR experiments and the results compared with the data available for other members of the same protein family. In a second part of the project a cL-BABP mutant (H98Q), in which the histidine in position 98 was substituted with a glutamine, was produced and analyzed to investigate the role of such residue in triggering the allosteric binding mechanism. The overall structure of the protein was substantially unaffected by the mutation, in spite of a slightly reduced stability. The analysis of the chemical shift changes between the WT and the mutant revealed the presence of long range effects in the 55-59 segment of the protein which makes contacts with one ligand. The analysis of the binding mode, investigated both through NMR and mass spectrometry (MS), indicated some disruption of binding cooperativity as evidenced by the reduced binding affinity for one ligand. The loss of affinity for one ligand was also confirmed by the comparison of the ligand diffusion coefficients (D) in the complexes of WT and H98Q. The protein mobility was also investigated and the NMR relaxation parameters, T1 and T2, were measured. The main effect of the mutation resulted in the quenching of the slow motions in the C-terminal region of the WT protein. The last part of the project was focused on the NMR characterization of the interactions of cL-BABP with anionic vesicles in the presence of the physiological ligand, i.e. glycochenodeoxycholic acid (GCDA). Initially the association with anionic vesicles, i.e., 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG) liposomes, was analyzed in the absence of bile acids and the electrostatic nature of the interaction was confirmed. Then the ternary complex cL-BABP/DMPG/GCDA was studied. The analysis of several NMR titration experiments clearly indicated that cL-BABP associates with DMPG liposomes in the apo form, while such interaction is weakened in the holo form. Indeed the addition of the physiological ligand to the protein-liposome mixture modulated this interaction, shifting the equilibrium towards the free folded holo protein. Thus membrane and ligands were shown to establish competing binding equilibria for the interaction with cL-BABP. These results supported a mechanism of ligand binding and release controlled by the onset of a bile salt concentration gradient within the polarized hepatic cell. The data obtained for the H98Q mutant allowed to clarify the key role of His98 in the modulation of the mobility observed in cL-BABP and its importance for an efficient cooperative bile acids binding. Finally, on the basis of the results of the interaction with the lisposomes, it has been proposed model for the intracellular bile acids transport in the hepatocytes that takes into account the intracellular bile acid concentration gradient.

Liver bile acid intracellular transporter: NMR studies of unfolding, cooperative binding and interaction with membrane mimetic.

PEDO', Massimo
2010-01-01

Abstract

Bile acids are cholesterol derived molecules which, together with phospholipids, cholesterol and bilirubin, represent the principal constituents of bile. Bile acids are detergent molecules which, in the intestinal tract, help the emulsification of fat, thus improving its absorption by the intestinal epithelia. Recently another important bile acid function has emerged linked to their role in many signalling processes. Some bile acid receptors have been indeed identified and several metabolic disorders, related to impaired bile acid dependent signalling, have been reported. Bile acids undergo, in the body, a recycling pathway between the intestine and the liver, called “enterohepatic circulation”, which assure the recovery of these molecules and their subsequent reutilization. Bile acids transport is achieved, in the enterocytes and in the hepatocytes, mainly through a protein mediated mechanism that involves transmembrane and intracellular transporters. In this study the intracellular bile acid transporter from chicken liver (cL-BABP) has been characterized through NMR spectroscopy. cL-BABP is a soluble protein of about 14 KDa with the three-dimensional structure represented by a 10 stranded beta barrel with a helix-turn-helix motive that covers the open end of the barrel. In the first part of the project the stability and unfolding mechanism of cL-BABP was investigated. The structural stability was analyzed through hydrogen-deuterium (HX) exchange experiments and the ΔGop was estimated. The protein unfolding mechanism was also investigated in a residue specific manner through urea titration NMR experiments and the results compared with the data available for other members of the same protein family. In a second part of the project a cL-BABP mutant (H98Q), in which the histidine in position 98 was substituted with a glutamine, was produced and analyzed to investigate the role of such residue in triggering the allosteric binding mechanism. The overall structure of the protein was substantially unaffected by the mutation, in spite of a slightly reduced stability. The analysis of the chemical shift changes between the WT and the mutant revealed the presence of long range effects in the 55-59 segment of the protein which makes contacts with one ligand. The analysis of the binding mode, investigated both through NMR and mass spectrometry (MS), indicated some disruption of binding cooperativity as evidenced by the reduced binding affinity for one ligand. The loss of affinity for one ligand was also confirmed by the comparison of the ligand diffusion coefficients (D) in the complexes of WT and H98Q. The protein mobility was also investigated and the NMR relaxation parameters, T1 and T2, were measured. The main effect of the mutation resulted in the quenching of the slow motions in the C-terminal region of the WT protein. The last part of the project was focused on the NMR characterization of the interactions of cL-BABP with anionic vesicles in the presence of the physiological ligand, i.e. glycochenodeoxycholic acid (GCDA). Initially the association with anionic vesicles, i.e., 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG) liposomes, was analyzed in the absence of bile acids and the electrostatic nature of the interaction was confirmed. Then the ternary complex cL-BABP/DMPG/GCDA was studied. The analysis of several NMR titration experiments clearly indicated that cL-BABP associates with DMPG liposomes in the apo form, while such interaction is weakened in the holo form. Indeed the addition of the physiological ligand to the protein-liposome mixture modulated this interaction, shifting the equilibrium towards the free folded holo protein. Thus membrane and ligands were shown to establish competing binding equilibria for the interaction with cL-BABP. These results supported a mechanism of ligand binding and release controlled by the onset of a bile salt concentration gradient within the polarized hepatic cell. The data obtained for the H98Q mutant allowed to clarify the key role of His98 in the modulation of the mobility observed in cL-BABP and its importance for an efficient cooperative bile acids binding. Finally, on the basis of the results of the interaction with the lisposomes, it has been proposed model for the intracellular bile acids transport in the hepatocytes that takes into account the intracellular bile acid concentration gradient.
2010
risonanza magnetica nucleare; epressione e purificazione di proteine ricombinanti; mutagenesi sito specifica; liposomi
Gli acidi biliari sono molecole derivanti dal colesterolo le quali, assieme con fosfolipidi, colesterolo e bilirubina rappresentano i principali costituenti della bile. Gli acidi biliari sono molecole detergenti le quali, nel tratto intestinale, favoriscono l’emulsione dei grassi migliorandone così l’assorbimento da parte dell’epitelio intestinale. Recentemente è stato scoperta un’altra importante funzione degli acidi biliari legata al loro ruolo in molti processi di signalling. Alcuni recettori degli acidi biliari sono stati identificati e sono stati riportati diversi disordini metabolici legati a difetti negli eventi di segnalazione dipendente da acidi biliari. Gli acidi biliari sottostanno, nel corpo, ad un processo di ricircolo tra l’intestino ed il fegato chiamato “circolazione enteroepatica” il quale garantisce il recupero ed il successivo riutilizzo di queste molecole. Il trasporto degli acidi biliari è realizzato, negli enterociti e negli epatociti, principalmente attraverso un meccanismo mediato da proteine trasportatrici e coinvolge trasportatori trans-membrana e intracellulari. In questo studio è stato caratterizzato, attraverso spettroscopia NMR, il trasportatore intracellulare di acidi biliari di fegato di pollo (cL-BABP). cL-BABP è una proteina solubile di circa 14 KDa la cui struttura tridimensionale è costituita da un barile beta con 10 filamenti e un motivo helix-turn-helix che copre la regione aperta del barile. Nella prima parte del progetto è stata studiata la stabilità ed il meccanismo di unfolding di cL-BABP. La stabilità strutturale è stata analizzata attraverso esperimenti di scambio idrogeno/deuterio (XH) ed è stato stimato il ΔGop. Il meccanismo di unfolding è stato studiato in maniera residuo specifica attraverso esperimenti NMR di titolazione con urea e i risultati sono stati confrontati con i dati disponibili per altri membri della stessa famiglia proteica. Nella seconda parte del progetto è stato prodotto e analizzato un mutante di cL-BABP (H98Q) in cui l’istidina in posizione 98 è stata sostituita con un residuo di glutammina allo scopo di studiare il ruolo di tale residuo nell’avviare il meccanismo di legame allosterico. La struttura globale della proteina è risultata sostanzialmente inalterata dalla mutazione, nonostante la stabilità risulti leggermente ridotta. L’analisi delle variazioni dei chemical shift tra la proteina WT ed il mutante ha rivelato la presenza di effetti a lunga distanza nel segmento 55-59 il quale risulta in contatto con un ligando. L’analisi della capacità di legame, studiato attraverso NMR e spettrometria di massa (MS), ha indicato una rottura del meccanismo di legame cooperativo evidente come una riduzione dell’affinità di legame per un ligando. La perdita di affinità per un ligando è stata confermata anche attraverso il confronto del coefficiente di diffusione (D) per i ligandi tra WT e H98Q. Nel corso del progetto è stata inoltre studiata la mobilità attraverso la misura NMR dei parametri di rilassamento T1 e T2. L’effetto principale della sostituzione è stato lo smorzamento dei moti lenti osservati nella regione C-terminale nella proteina WT. L’ultima parte del progetto è stata focalizzata sulla caratterizzazione, via NMR, dell’interazione di cL-BABP con vescicole anioniche in presenza del ligando fisiologico, cioè acido glicochenodeossicolico (GCDA). Inizialmente l’associazione con vescicole anioniche, cioè liposomi di 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), è stata analizzata in assenza di acidi biliari ed è stata confermata la natura elettrostatica dell’interazione. Successivamente è stato studiato il complesso ternario cL-BABP/DMPG/GCDA. L’analisi di diversi esperimenti NMR di titolazione ha indicato che cL-BABP si associa con liposomi di DMPG nella condizione apo, mentre l’interazione è indebolita nella forma olo. Infatti l’aggiunta del ligando fisiologico alla miscela proteina-liposoma modula l’interazione, spostando l’equilibrio verso la forma olo libera della proteina. Quindi membrana e ligandi sono in competizione per l’interazione con cL-BABP. Questi risultati supportano un meccanismo di legame e rilascio dei ligandi controllato dal gradiente di concentrazione di sali biliari presente nelle cellule epatiche polarizzate. I dati ottenuti dallo studio di H98Q hanno permesso di chiarire il ruolo chiave dell’istidina 98 nella modulazione della mobilità osservata in cL-BABP e la sua importanza nel determinare un efficiente legame cooperativo degli acidi biliari. È stato infine proposto, sulla base dei dati di interazione con liposomi, un meccanismo per il trasporto intracellulare degli acidi biliari nelle cellule epatiche che tiene conto del gradiente intracellulare di acidi biliari.
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