Studio ed analisi del fosfoproteoma della membrana del globulo rosso patologico

Il recente sviluppo di nanotecnologie, di nuovi strumenti per l’analisi e l’elaborazione bioinformatica, la disponibilità di enormi database facilmente accessibili, insieme al completo sequenziamento del genoma umano, hanno aperto nuovi orizzonti alla ricerca biomedica. Inoltre, lo sviluppo dell’analisi con gene-micro-array1, che è in grado di valutare il profilo di espressione di 50.000-80.000 geni contemporaneamente, ha permesso di individuare nuovi geni coinvolti nella patogenesi di diverse malattie e ha senz’altro evidenziato come il prodotto proteico finale spesso non corrisponda al profilo di espressione dei geni corrispondenti, indicando quindi l’esistenza di eventi in grado di intervenire sulle proteine neo-sintetizzate, modificandone la struttura ed influenzandone la funzione come evidenziato dal divario tra genotipo e fenotipo in patologie di interesse medico. In questo contesto, le modificazioni post-traduzionali delle proteine (MPT) costituiscono gli eventi chiave che intervengono sulle funzioni delle proteine e sulle attività cellulari in cui in esse sono coinvolte. Alla luce di queste considerazioni, parte della ricerca biomedica si è rivolta allo studio delle proteine e delle loro possibili MPT in vari contesti fisiopatologici di biologia cellulare. Ad oggi si conoscono più di duecento tipi differenti di MPT2, tra cui si annoverano la glicosilazione, la solforilazione, la nitrosilazione e la fosforilazione. Tra queste MPT, alcune sono reversibili quali, ad esempio, le fosforilazioni e le nitrosilazioni ed in quanto tali sono importanti nelle diverse attività della cellula, nella regolazione di processi biologici e in risposta a stress cellulari. La fosforilazione delle proteine è posta sotto il controllo dell’azione combinata di due classi di enzimi: (1) le protein kinasi, che catalizzano il trasferimento di un gruppo fosforile da un composto ad alta energia ad un residuo amminoacidico (fosforilazione); (2) le protein fosfatasi, che catalizzano l’idrolisi del legame fosfoesterico (defosforilazione). Nelle cellule eucariotiche, la forma più diffusa di fosforilazione è la formazione di un fosfoestere con il gruppo R di tirosine o di serine o treonine3. La tirosina si trova 1000 volte meno fosforilata rispetto alla serina e 100 volte rispetto alle treonina. Esistono anche fosforilazioni che interessano altri tipi di residui amminoacidici come le istidine, le arginine, gli acidi aspartici, le cisteine e gli acidi glutammici, ma la loro funzione non è stata ancora caratterizzata. L’importanza biologica della fosforilazione/defosforilazione a livello cellulare è sottolineata anche dall’elevato numero di geni che codificano per kinasi o fosfatasi in differenti modelli cellulari. Si calcola, infatti, che circa il 2% dell’intero genoma umano sia costituito da geni che codificano proteine appartenenti a queste due classi enzimatiche4,5. Le kinasi/fosfatasi e quindi la fosforilazione/defosforilazione delle proteine sono molto importanti nelle diverse attività cellulari quali: il metabolismo cellulare, il ciclo cellulare, il riarrangiamento delle proteine plasma-membrana, il movimento cellulare, la degradazione delle proteine, la formazione di complessi proteici, l’apoptosi e la differenziazione cellulare. Inoltre, nelle cellule eucariotiche i cambiamenti nello stato di fosforilazione delle proteine sono parte integrante delle vie di trasduzione del signaling intracellulare in risposta a stimoli esterni, ed anche del signaling intercellulare. Studi condotti fino ad ora sul profilo di fosforilazione hanno permesso di identificare alcuni gruppi di proteine che più frequentemente, rispetto ad altre, sono interessate da cambiamenti dello stato di fosforilazione, in particolare: le proteine strutturali della membrana, le chaperonine, i fattori di trascrizione e i recettori di membrana. Si stima che il 30% di tutte le proteine cellulari siano fosforilate. Spesso la fosforilazione avviene in siti multipli con effetti distinti sulla funzione della proteina stessa. Ecco perché difetti o alterazioni nei geni codificanti per kinasi/fosfatasi o alterazioni a carico di siti fosforilabili/defosforilabili delle proteine possono alterare così profondamente le funzioni cellulari da contribuire in modo determinante al divario osservato tra genotipo e fenotipo. Solo recentemente, grazie allo sviluppo di nuove tecnologie, supportato dall’aumento delle conoscenze, si è potuti passare dallo studio di una singola proteina e del suo stato di fosforilazione, allo studio di complessi network di interazioni delle proteine che si esplicano attraverso la fosforilazione dei diversi effettori che vi fanno parte. Si è passati quindi allo studio del fosfoproteoma, ovvero dell’insieme delle proteine fosforilate in un dato momento cellulare e/o a seguito di un determinato stress a cui la cellula è stata sottoposta. Nello studio del fosfoproteoma si utilizzano le cosiddette metodiche ad alto livello tecnologico ( o high-throughoutput) tra cui l’elettroforesi bidimensionale su gradiente immobilizzato (2-DE) e la spettrometria di massa (MALDI-TOF). Tali metodiche possono essere associate in un approccio integrato (integrated proteomic) ad analisi in Westernblot con anticorpi specifici, per esempio anticorpi anti-fosfotirosina, che permettono di individuare spot differentemente tirosin-fosforilati in campioni messi a confronto. Successivamente all’analisi di immagine, tali spot/proteine possono essere identificate con precisione utilizzando la spettrometria di massa e la ricerca in banca dati (es NCBI database).

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