Applicazione della tecnica AFLP-TP per lo studio dell'espressione genica in pianta

La collezione dei geni che vengono espressi, chiamata anche profilo di espressione o trascrittoma, è il maggior determinante di un fenotipo. Diversamente dal genoma, il trascrittoma è molto dinamico e cambia rapidamente sia in risposta alle perturbazioni sia durante i normali eventi cellulari. Per caratterizzare un gene, è importante determinare il prodotto codificato dal gene stesso e come, dove e quando questo gene venga espresso. Inoltre lo studio dei cambiamenti dei profili di espressione può contribuire a comprendere i meccanismi regolatori di un fenomeno e le vie biochimiche che vengono coinvolte nel fenomeno in esame. Gli esperimenti di analisi dei profili di espressione, pertanto, possono rispondere a diversi problemi biologici. Infatti, monitorando i cambiamenti di questi profili in risposta ad un particolare trattamento o ad uno stimolo, è possibile ottenere il quadro completo di un certo processo biologico. Le tecniche di indagine dell’espressione genica su larga scala sono numerose; tra queste le più utilizzate sono: suppression subtractive hybridization (SSH), differential display reverse transcription PCR (DDRT-PCR), representational difference analysis of cDNA (cDNA-RDA), serial analysis of gene expression (SAGE), massively parallel signature sequencing (MPSS), microarray e amplified fragment length polymorphism - based transcript profile (AFLP-TP). In questo lavoro di tesi è stata applicata la tecnica AFLP-TP per l’analisi dei profili trascrizionali su ampia scala di tre differenti sistemi biologici. Innanzitutto è stata analizzata la regolazione genica da parte dell’ossido nitrico e del perossido d’idrogeno durante l’induzione della morte cellulare ipersensibile in Nicotiana tabacum. Sono stati rilevati 330 frammenti differenzialmente espressi, che sono stati raggruppati in cinque cluster principali. Sono state ottunute 214 sequenze, di cui il 59% non ha omologia con sequenze note di tabacco depositate in banca dati. La riproducibilità dell’esperimento è stata verificata analizzando anche una replica biologica. Il confronto dei risultati relativi ai due esperimenti ha mostrato un accordo dei profili di espressione superiore al 90% e una correlazione significativa. Per validare i risultati ottenuti dall’analisi AFLP-TP, i profili di espressione osservati per dieci frammenti appartenenti ai cinque differenti cluster sono stati analizzati utilizzando la tecnica real-time PCR. L’analisi di regressione tra i dati ottenuti mediante real-time PCR e quelli mediante AFLP-TP ha mostrato una correlazione significativa. L’AFLP-TP è stata poi applicata per studiare l’espressione genica dipendente da fosfatidilinositolo-3-fosfato durante l’arricciamento dei peli radicali nella simbiosi in Medicago truncatula. Sono stati identificati 22 geni putativi, 7 dei quali non sono presenti nella banca dati MtGI. Infine sono stati rilevati 2000 frammenti differenzialmente espressi durante la maturazione e l’appassimento della bacca di Vitis vinifera, che sono stati raggruppati in cluster, secondo il loro profilo di espressione. Sono state ottenute 1270 sequenze di buona qualità, di cui il 27% è risultato assente dalla banca dati di vite VvGI. L’applicazione della tecnica AFLP-TP, quindi, ha permesso di studiare i geni che vengono differenzialmente espressi durante i processi in esame e di identificare geni nuovi, non ancora presenti nelle banche dati pubbliche. Questa tecnica si è dimostrata utile sia per analizzare processi specifici, identificando i geni modulati da molecole segnale, sia per studiare processi complessi come la maturazione e l’appassimento della bacca, in cui si ha la regolazione di migliaia di geni. L’AFLP-TP si è rivelata una tecnologia efficiente, sensibile e riproducibile e, non richiedendo la conoscenza delle sequenze di DNA, è uno strumento utile per l’analisi dell’espressione genica e per l’identificazione di nuovi geni. Per questo motivo, resta la scelta migliore per l’analisi dell’espressione genica in organismi poco studiati.

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