Caratterizzazione elettrofisiologica e morfologica di sinapsi glutammatergiche nel muscolo scheletrico di mammifero

Ogni azione effettuata dal sistema nervoso come la percezione dei segnali sensoriali il controllo motorio, le funzioni cognitive come l’apprendimento e la memoria, dipende da precise connessioni a livello dei neuroni. Queste specifiche connessioni sono realizzate durante la fase di sviluppo embrionale e post-natale. Lo studio dei meccanismi che sono alla base della formazione dei complessi circuiti neuronali ha da sempre affascinato ed interessato un ampio numero di scienziati. Negli ultimi decenni, gli avanzamenti delle tecniche di microscopia e di biologia molecolare hanno contribuito ad aumentare le nostre conoscenze sui principali meccanismi alla base della formazione delle sinapsi e sulle molecole responsabili della specificità delle connessioni sinaptiche. Nonostante l’enorme progresso delle nostre conoscenze nel campo restano ancora molti quesiti senza risposta, come ad esempio, non sono ancora noti i meccanismi che determinano il tipo di neurotrasmettitore nei neuroni. E’ noto che la giunzione neuromuscolare di mammifero utilizza come neurotrasmettitore l’acetilcolina, ma recentemente, è stato osservato che in particolari condizioni neuroni glutammatergici di mammifero sono in grado di formare sinapsi funzionali con fibre muscolari. Infatti in uno studio eseguito su ratto da un gruppo di ricercatori dell’Università di Brescia, è stato osservato che, con l’innesto di un nervo periferico tra il midollo spinale e un muscolo addominale, è possibile sostituire la sinapsi colinergica della giunzione neuromuscolare, con una nuova connessione glutammatergica proveniente da neuroni sopraspinali. Inoltre, è stato osservato che i mioblasti dello Xenopus durante lo sviluppo esprimono una grande varietà di recettori per vari tipi di neurotrasmettitori e che a seconda del fenotipo neurotrasmettitoriale, espresso dal terminale presinaptico, le cellule muscolari mantengono l’appropriato recettore, suggerendo così, che la scelta del tipo di recettore dipende dal neurotrasmettitore liberato. Lo scopo della mia tesi è quello di approfondire i meccanismi alla base della formazione delle insolite sinapsi glutammatergiche muscolari nel mammifero. Nella prima parte del lavoro ho cercato di studiare mediante tecniche di elettrofisiologia intracellulare le sinapsi glutammatergiche muscolari che si formano in vivo tra vie discendenti e fibre muscolari nel ratto. Da questa prima parte non ho ottenuto delle registrazioni intracellulari in quanto gli animali operati hanno presentato tutti innervazione di tipo colinergico. Nella seconda parte del lavoro ho caratterizzato, con tecniche morfologiche, elettrofisiologiche e di biologia molecolare la formazione in vitro di sinapsi glutammatergica tra neuroni corticali e cellule di muscolo scheletrico di mammifero. Studi di immunofluorescenza hanno evidenziato la presenza di recettori AMPA (AMPAR) su cellule muscolari in cocoltura con neuroni corticali. In colture di soli miotubi il AMPAR non è espresso. In studi di imaging del calcio ho osservato che in seguito a stimolazione dei neuriti che contattano i miotubi si ha un incremento della concentrazione di calcio intracellulare. La stimolazione dei neuriti ha indotto contrazione dei miotubi. La somministrazione del curaro, un antagonista dei recettori colinergici, non ha modificato la contrazione della cellula muscolare, mentre la somministrazione di un antagonista dei recettori per il glutammato ha immediatamente bloccato la contrazione dei miotubi. Infine studi di immunoprecipitazione ed immunoblotting eseguiti su cocolture di neuroni corticali e cellule muscolari hanno dimostrato che il recettore del glutammato di tipo AMPA è espresso solamente dalle cellule muscolari in cocoltura e che l’espressione del recettore è accompagnata dalla presenza di proteine che solitamente costituiscono la struttura postsinaptica di sinapsi centrali. Quindi i risultati del mio lavoro hanno dimostrato, per la prima volta, che è possibile indurre la formazione in vitro di una sinapsi glutammatergica nelle fibre muscolari di mammifero.

Each of the behavioral tasks performed by the nervous system, from the perception of sensory input and the control of motor output to cognitive functions such as learning and memory, depends on precise interconnections of many millions of neurons. These connections are developed during embryonic and post natal development. The study of the mechanisms that underlie synaptic formation has always interested a great number of scientists. In the last ten years, microscopy and molecular biology techniques have supplied a great number of knowledges about the mechanisms of synaptic formation. Despite the amount of information about synaptogenesis there are still many unknown processes behind the development of a synapse, such as the mechanisms that induce the correct expression of neurotransmitters (and their receptors). It is well known that acetylcholine is the only neurotransmitter in mammalian neuromuscular junction, but recently it has been demonstrated that glutamatergic neurons are able to form functional synapses with mammalian muscle under particular conditions. At the University of Brescia it has been observed that a new glutamatergic innervation of skeletal muscle replaces the original cholinergic one when the transversus abdominal muscle is denervated and a distal nerve stump is inserted in the white lateral matter of spinal cord in rat. Moreover, Xenopus muscle cells express several classes of transmitter receptors in addition to those for acetylcholine in early embryonic development. During normal differentiation and innervation of muscle, the other classes of receptors disappear. Changing the expression of transmitters by altering calcium spike activity leads to retention of the classes of cognate, noncholinergic receptors. This indicates that the expression of appropriate receptors is due to the neurotransmitter The aim of this work was to study the mechanisms that underlie the formation of glutamatergic muscular synapses observed at the University of Brescia. Muscles, to which descending glutamatergic fibres had been diverted from the spinal cord by means of a peripheral nerve graft, were studied by intracellular electrophysiological techniques in the first part of the project. Surgical procedures were performed at Brescia University. Unfortunately, all analyzed muscles showed cholinergic innervation. In the second part of the project, murine co-cultures with cortical neurons and skeletal muscle cells were developed. Electrophysiological, biochemical and morphological analysis showed that, under these conditions, cortical neurons develop functional glutamatergic synapses with muscle cells. Immunofluorescence studies also have demonstrated the presence of AMPA receptors (AMPARs) on muscular cells in the cocultures. Calcium imaging studies showed that electrical stimulation of cortical neurites, reaching myotubes, induced an increase of intracellular calcium concentration in the muscular cells. Electrical stimulation of neurites also produced contraction of myotubes. The contractions were resistant to curare, a common blocker of acetylcholine receptors, but they were sensitive to the glutamate AMPAR antagonist (GYKI 52466). Finally, coimmunoprecipitation and immunoblotting analysis demonstrated that only myotubes cocultured with cortical neurons express AMPARs and moreover it was seen that muscle cells express proteins of central post synaptic density (PSD). These data show, for the first time, that it is possible to induce the formation of a glutamatergic synapse on mammalian muscle cell in vitro.