Integrated proteomic analysis of normal and diseased red cells. Role of physiological stresses in erythrocyte signaling pathways

Il globulo rosso è una cellula altamente specializzata per il trasporto di ossigeno e anidride carbonica. Studi di fisiopatologia eritroide hanno permesso di riconoscere 4 compartimenti fondamentali: la membrana, il citoscheletro, gli enzimi citosolici e l’emoglobina. Alterazioni a carico di uno di questi compartimenti sono responsabili di profonde anomalie nell’organizzazione funzionale degli eritrociti, che si traducono clinicamente in anemie ereditarie o acquisite. Le anemie ereditarie sono sostenute da mutazioni monogeniche e la loro diffusione e’ legata alla selezione positiva indotta dalla malaria. Tra i disordini ereditari dei globuli rossi, l’organizzazione mondiale della sanita’ (OMS) ha identificato le emoglobinopatie e in particolare le β-talassemie come malattie emergenti in tutte le aree geografiche del mondo. L’enorme differenza tra il genotipo e il fenotipo clinico dell’emoglobinopatie suggerisce che eventi post-traslazionali possano essere giocare un ruolo importante nelle interazioni proteina-proteina coinvolte nelle diverse funzioni cellulari, influenzando in ultima analisi le manifestazioni cliniche di queste malattie. Tra le modificazioni post-traslazionali a carico delle proteine gli eventi di fosforilazione/defosforilazione sostenuti da chinasi/fosfatasi costituiscono uno degli elementi chiave nella trasduzione del segnale coinvolti nell’omeostasi cellulare. Gli scopi del presente progetto di ricerca sono stati quelli di caratterizzare vie di segnale intracellulare in risposta a stress in globuli rossi normali e patologici. Nella prima parte della ricerca abbiamo analizzato l’espressione e la localizzazione di perossiredossina-2 (Prx2) in globuli rossi di 2 modelli murini di β-talassemia caratterizzati da diversa gravita’ del fenotipo ematologico (Hbbth/th e Hbbth3/+). Nei globuli rossi β- talassemici abbiamo descritto (paper submitted to Blood, 2009) un’aumentata espressione di Prx2 ma una riduzione nella quantità di Prx2 legata alla membrana a fronte di un grave danno ossidativo. Utilizzando un’analisi di proteomica integrata abbiamo dimostrato che una parte di Prx2 legata alla membrana e’ fosforilata e che questa modificazione posttraslazionale influenza la funzione di Prx2 e la sua fisiologica risposta al danno ossidativo. Nella seconda parte del progetto sono stati analizzati gli effetti della deossigenazione sul proteoma di membrana dei globuli rossi di topi geneticamente deficienti di Fgr, Hck e Lyn, chinasi della famiglia del Src (fgr-/-hck-/-; fgr-/-hck-/-lyn-/-). Sulla base di studi preliminari in proteomica classica, abbiamo condotto un’analisi comparativa del fosfoproteoma della membrana dei globuli rossi dei 3 ceppi murini esposti a deossigenazione. Questi dati ci hanno permesso di individuare il nuovo ed importante ruolo di chinasi della famiglia del Src e di Syk nella trasduzione del segnale in risposta all’ipossia nei globuli rossi. Lo sviluppo di queste metodologie e l’acquisizione di dati scientifici originali su nuove vie di trasduzione del segnale in globuli rossi normali e patologici ha permesso di contribuire allo studio della modulazione delle heat shock protein (HSP27; HSP70) e della Prx2 in globuli rossi di pazienti affetti da anemia falciforme (Proteomics Clin. Appl. 2008, 2, 706- 719) e allo studio della modulazione degli eventi di fosforilazione della banda 3 da parte di Syk in globuli rossi normali e di pazienti affetti da deficit di Glucosio-6-fosfato-deidrogenasi (Biochem J. 2009, 418, 359-367).

Peroxiredoxin 2 (Prx2) is the third most abundant cytoplasmic protein in red blood cells (RBCs) and is involved at least in part in defence against oxidative stress. Here, we examined the expression and localization of Prx2 in RBCs from two murine models of β thalassemia (Hbbth3/+, Hbbth/th) and in normal RBCs treated with phenylhydrazine (PHZ) as β thalassemic-like RBCs. Prx2 expression was higher in β thalassemic mouse models than in normal RBCs without effects of cell density/age. Dimeric Prx2 was only detectable in β thalassemic RBC lysates and related with the severity of the hematological phenotype. Although β thalassemic RBC membrane is characterized by a severe oxidative damage, we found Prx2 translocated from the membrane to the cytosol, without detectable dimers as also observed in β thalassemic-like RBCs. We generated 2D maps of the phosphoenriched RBC membrane proteins, and in the area where Prx2 was expected to migrate, anti-phosphotyrosine staining was observed, which was further identified as Prx2 by both mass-spectrometric and immunoblot-analysis. These data demonstrate that a population of Prx2 associated with the membrane is tyrosine-phosphorylated and that tyrosine phosphorylation might regulate both the oligomeric state and membrane association of Prx2, regardless of the oxidation state of the cell.