IL-10 and miRNAs as modulators of gene expression in lipopolysaccharide-activated neutropils and monocytes

Il processo infiammatorio è costituito dalla successione temporale di eventi coordinati dalla presenza di distinte citochine pro- e antinfiammatorie. Il mancato controllo temporale e/o dell'entità della risposta infiammatoria può svolgere un ruolo importante nello sviluppo di patologie infiammatorie croniche e autoimmuni. In questo contesto, è noto che il corretto equilibrio nella produzione di citochine pro- e anti-infiammatorie è essenziale per il corretto sviluppo dell’infiammazione mirata ad eliminare gli agenti patogeni senza danno ai tessuti. Di conseguenza, è evidente che la caratterizzazione delle vie di trasduzione del segnale che regolano l’espressione dei geni codificanti per citochine durante l’infiammazione è di particolare importanza, dal momento che permette di chiarire quali siano gli eventi fondamentali nel determinare l’insorgenza di patologie nelle quali il processo infiammatorio risulta deregolato. L’entità e la durata della risposta infiammatoria sono finemente regolate dall’ Interleuchina (IL)-10, una potente citochina antinfiammatoria, in grado di limitare l’espressione e la produzione di citochine e chemochine pro-infiammatorie e promuovere il rilascio di molecole antinfiammatorie da monociti, macrofagi e neutrofili attivati in seguito a stimolazione dei recettori Toll-like (TLRs), come il lipopolisaccaride (LPS) batterico. Nonostante l’IL-10 sia una citochina molto studiata per le sue attività antinfiammatorie ed immunomodulatorie, il meccanismo molecolare attraverso cui esercita le sue azioni biologiche è ancora controverso. Lo scopo di questa tesi è quello di caratterizzare i meccanismi molecolari attraverso i quali l’IL-10 modula l’espressione di geni codificanti per citochine in neutrofili e monociti umani attivati dall’LPS. In particolare, lo studio si è articolato in modo da perseguire due obiettivi principali: (A) caratterizzare i meccanismi attraverso i quali l’IL-10 modula l’espressione di geni codificanti per citochine a livello trascrizionale; (B) analizzare la capacità dell’IL-10 di regolare l’espressione genica in neutrofili e monociti a livello post-trascrizionale, in particolare attraverso la modulazione dei miRNA. (A) I risultati ottenuti attraverso l’ analisi quantitativa dei trascritti primari di diverse citochine dimostrano che l’IL-10 esercita la sua attività antinfiammatoria principalmente inibendo la trascrizione dei geni indotti dall’LPS. Inoltre, i nostri dati dimostrano che l’azione inibitoria dell’IL-10 sull’espressione dei geni codificanti per TNF-α e CXCL8 procede attraverso una prima fase diretta ed una successiva fase dipendente da sintesi proteica. (B) Nella seconda parte dello studio abbiamo analizzato se l’IL-10 potesse regolare l’espressione di citochine indotte dalla stimolazione con LPS anche mediate meccanismi post-trascrizionali, in particolare attraverso l’azione dei miRNA. Mediante un’analisi su larga scala, abbiamo inizialmente caratterizzato il profilo di espressione dei miRNA indotti in risposta all’LPS. Quindi abbiamo studiato gli effetti dell’IL-10 sull’espressione dei miRNA identificati. Questo studio ci ha permesso di dimostrare per la prima volta che l’IL-10 è in grado di modulare l’espressione di miRNA indotti dall’LPS. Abbiamo quindi condotto uno studio più approfondito sui meccanismi che regolano l’espressione e le funzioni biologiche del miR-9 e del miR-187, gli unici due miRNA modulati dall’IL-10 sia nei neutrofili che nei monociti. Infine, abbiamo identificato il fattore di trascrizione NFKB1/p105/p50 come target di miR-9. Complessivamente questo studio ha dimostrato che l’IL-10 è in grado di regolare l’espressione genica sia di citochine che di miRNA agendo principalmente a livello trascrizionale. D’altra parte i miRNA regolati dall’IL-10 possono influenzare l’espressione genica dei loro target attraverso meccanismi post-trascrizionali. I risultati di questo studio suggeriscono che l’IL-10 modula l’espressione genica di neutrofili e monociti attraverso circuiti distinti, intervenendo direttamente a livello della trascrizione ed indirettamente, attraverso i miRNA, a livello post-trascrizionale.

The inflammatory process consists of a coordinated, sequential and self-limiting release of different mediators that orchestrate and control the chronological phases of leukocytes recruitment, activation, and clearance. In this contest, it is well known that the appropriate balance between pro- and anti-inflammatory cytokines production and action is essential for successful innate immune response that clears infectious pathogens but limits tissue damage and autoimmunity. Based on these knowledges, it is evident that the characterization of the pathways and checkpoints that regulate cytokine gene expression during physiologic inflammation is of particular importance, since it will yield insights into fundamental events occurring in disorders characterized by deregulated inflammation. The amplitude and the duration of the inflammatory response are fine-tuned by Interleukin (IL)-10, a potent antinflammatory cytokine produced, among others, by myeloid cells in response to Toll-like receptor (TLR) activation and, in turn, very effective at suppressing TLR-induced gene expression and inflammatory cytokine production. Although IL-10 antinflammatory properties have been thoroughly described, the molecular mechanisms governing IL-10 production and actions on cells of the innate immune system have not been fully elucidated yet. The purpose of the thesis is to provide a comprehensive characterization of the molecular mechanisms through which IL-10 modulates cytokine gene expression in human neutrophils and monocytes exposed to lipopolysaccharide (LPS). In particular, the study is focused on two main goals: (A) characterization of the mechanisms through which IL-10 modulates cytokine gene expression at the transcriptional level; (B) analysis of the role of IL-10 on post-transcriptional regulation of neutrophils and monocytes gene expression, via modulation of miRNAs. (A) Our results demonstrate that, in neutrophils and monocytes stimulated with LPS, IL-10 primarily targets the transcription of TNF-α, CXCL8 and IL-1ra genes, as revealed by Primary Transcript (PT) real-time RT-PCR. In addition, we show that the transcriptional repression of TNF-α and CXCL8 gene expression induced by IL-10 consists of two distinct phases: an early one, occurring rapidly and in a protein synthesis-independent manner, followed by a second phase, more delayed and dependent on protein synthesis. (B) In the second part of the thesis we addressed the question whether IL-10 could regulate LPS-induced cytokine expression also by using post-transcriptional mechanisms, in particular through the action of miRNAs. We initially characterized the profile of miRNAs induced in response to LPS. Subsequently, the effect of IL-10 on LPS-induced miRNA expression was characterized. This analysis, performed on a large scale, revealed a previously unrecognized ability of IL-10 to modulate the expression of miRNA induced in response to LPS. We specifically characterized the induction and the regulatory functions of LPS-induced miR-9 and miR-187, being the only miRNAs respectively down- or up-regulated by IL-10 in both cell types. Finally, NFKB1/p105/p50 was identified in silico and experimentally as a miR-9 target. In summary, the present work demonstrated that IL-10 can modulate the expression of both cytokines and miRNAs at the transcriptional level. In turn, , IL-10-regulated miRNAs could post-transcriptionally influence the expression of specific target genes involved in the regulation of transcription. Collectively these results suggest that IL-10 is able to influence the final output of neutrophils and monocytes gene expression by acting directly at the level of transcription and indirectly, via miRNA, at a post-transcriptional level.