Expression of murine and viral interleukin-10 in tobacco for immunomodulation of galt for the prevention of autoimmune diseases

L’interleuchina-10 (IL-10) e’ una citochina immunosoppressiva con potenziale applicazione terapeutica in diverse malattie autoimmuni e infiammatorie. La somministrazione orale di questa citochina, da sola o in combinazione con autoantigeni associati alla malattia, potrebbe conferire protezione dall’insorgenza di specifiche malattie autoimmuni attraverso l’induzione di tolleranza orale. Un valido sistema alternativo per la produzione di proteine ricombinanti di interesse farmaceutico è rappresentato dalle piante transgeniche, data la possibilità di estendere la produzione su larga scala a bassi costi, e i minimi requisiti che richiedono per il loro mantenimento. Le piante, inoltre, possono essere assunte direttamente come alimento e potrebbero diventare esse stesse veicoli per la somministrazione delle proteine ricombinanti eliminando la necessità di purificarle. Ci si è proposti di valutare se le piante di tabacco fossero in grado di produrre alti livelli di IL-10 virale e murina biologicamente attiva. Per ottenere alti livelli di espressione dei transgeni, sono state effettuate sia la trasformazione dei plastidi, sia la trasformazione nucleare, valutando diverse strategie di localizzazione delle proteine ricombinanti. La trasformazione dei cloroplasti è risultato un approccio non attuabile per la produzione di IL-10 virale o murina ricombinante, in quanto i livelli di accumulo sono risultati decisamente insoddisfacenti per entrambi i transgeni. Invece, per quanto riguarda la trasformazione nucleare, sono state valutate tre diverse strategie di localizzazione sub-cellulare, per dirigere la proteina ricombinante nel reticolo endoplasmico (RE), nel citosol e nell’apoplasto, dapprima in esperimenti di espressione transiente e, successivamente, sono state generate piante transgeniche stabili con il costrutto che aveva fornito i più alti livelli di accumulo indirizzando la proteina nel RE. Le proteine ricombinanti sono state purificate da materiale fogliare transgenico e sono state caratterizzate rispetto alla composizione degli N-glicani, alla dimerizzazione, alla loro stabilità e attività biologica in saggi in vitro. Entrambe le molecole prodotte in pianta formano dimeri stabili, e sono in grado di attivare la cascata di trasduzione del segnale di IL-10 e di indurre risposte anti-infiammatorie specifiche nella linea cellulare di macrofagi murini J774. E’ stato dimostrato che le piante di tabacco sono in grado di processare correttamente l’IL-10 virale e murina in dimeri biologicamente attivi, e che quindi rappresentano una valida piattaforma per la produzione di queste citochine. Inoltre, i livelli di accumulo ottenuti sono sufficientemente elevati da permettere di somministrare una dose immunologicamente rilevante di IL-10 in una ragionevole quantità di materiale fogliare, senza richiedere laboriose purificazioni. Questo lavoro apre la strada alla realizzazione di studi di somministrazione orale in modelli murini di malattie autoimmuni, che permetteranno di effettuare una valutazione comparativa delle proprietà immunomodulatorie nonché dell’efficacia delle IL-10 virale e murina nell’indurre tolleranza orale.

Interleukin-10 (IL-10) is a potent anti-inflammatory cytokine, with therapeutic applications in several autoimmune and inflammatory diseases. Oral administration of this cytokine, alone or in combination with disease-associated autoantigens, could confer protection form the onset of a specific autoimmune disease through the induction of oral tolerance. Transgenic plants are attractive systems for production of therapeutic proteins because of the ability to do large scale-up at low cost, and the low maintenance requirements. They are highly amenable to oral administration and could become effective delivery systems without extensive protein purification. The ability of tobacco plants to produce high levels of biologically-active viral and murine IL-10 was investigated. To reach high accumulation levels of the transgenes, plastid transformation of the IL-10 genes as well as different targeting strategies of the nuclear encoded recombinant proteins were investigated. Chloroplast transformation turned out not to be a feasible approach for the recombinant production of IL-10, as unsatisfactory accumulation levels were obtained upon expression of both transgenes. For tobacco nuclear transformation, three different subcellular targeting strategies, directing the recombinant protein into the endoplasmic reticulum (ER), cytosol and apoplast, were first assessed in transient expression experiments, and stable transgenic plants were then generated with the constructs that yielded the highest accumulation levels by targeting the recombinant proteins to the ER. The recombinant proteins were purified from transgenic leaf material and characterized in terms of their N-glycan composition, dimerization, stability and biological activity in in vitro assays. Both molecules formed stable dimers, were able to activate the IL-10 signaling pathway and to induce specific anti-inflammatory responses in mouse J774 macrophage cells. It was therefore demonstrated that tobacco plants are able to correctly process viral and murine IL- 10 into biologically active dimers, representing a suitable platform for the production for these cytokines. The accumulation levels obtained are high enough to allow delivery of an immunologically relevant dose of IL-10 in a reasonable amount of leaf material, without extensive purification. This study paves the way to performing feeding studies in mouse models of autoimmune diseases, that will allow evaluation of the immunomodulatory properties and effectiveness of the viral and murine IL-10 in inducing oral tolerance.